Tests de bioactivité pour la défense et la régulation de la croissance

Sujet de recherche



Notre projet vise à identifier et caractériser les effets biologiques de composés de champignons et/ou d'origine végétale et à les valoriser. Pour ce faire, nous avons besoin de systèmes tests - faciles à mettre en œuvre à une échelle réduite, fiables et rapides. Ce défi sera relevé par la création d'une bio-puce associée à un marqueur biologique selon une stratégie empruntée à la Biologie Synthétique. Les plantes ou les cellules végétales en culture sont « remodelées » de sorte que l'on puisse directement « voir » si elles activent leur système immunitaire ou si elles modifient leur croissance en présence d'un composé actif.

Afin de détecter l'activation de l'immunité, des cellules végétales utilisées à l'institut de botanique du KIT expriment une construction génique qui génère une fluorescence verte quand les systèmes de défense sont induits. Ces signaux lumineux sont quazntifiables. L'activité du gène du facteur de transcription MYB14 est toujours corrélée à l'activation de la réponse immunitaire basale - une sorte de défense à large spectre qui inhibe de nombreux agents pathogènes. Nous utilisons une version particulièrement efficace de ce gène (commutateur) de la vigne sauvage européenne (Vitis sylvestris), l'ancêtre de nos raisins cultivés, que nous avons isolée au cours d'un précédent projet Interreg (BACCHUS). La construction utilisée correspond à la séquence génique qui contrôle l'activation de MYB14, placée en amont de la séquence génique qui code pour la protéine fluorescente verte originaire d'une méduse. Ainsi, chaque fois que l'une de nos substances testées active l'immunité basale, la séquence de contrôle de MYB14 devient active, la protéine fluorescente verte est synthétisée et nous pouvons l'observer et la mesurer. Cette construction génique a été introduite dans les cellules de tabac BY-2 en culture. L'étape suivante consiste à "calibrer" ce système rapporteur. Pour ce faire, ces cellules génétiquement modifiées sont traitées avec différentes quantités de flg22, un peptide bactérien qui active l'immunité basale et est utilisé comme contrôle positif. Après le "calibrage", notre système rapporteur fluorescent sera intégré à la puce microfluidique et nous pourrons alors commencer à mesurer les souches fongiques fournies par l'IBWF Kaiserslautern.
Afin de détecter l'effet d'un composé fongique ou végétal sur la croissance des plantes, il faut mettre au point un système de mesure. Dans ce projet, nous mesurerons les capacités et vitesses de croissance de graines d'Arabidopsis thaliana, encore appelée Arabette des dames. Pour ce faire, les graines sont semées individuellement dans des cônes de milieu gélosé et placées sur la bio-puce montées sur lame de verre fournie par le KIT - Institut für Mikrostrukturtechnologie. Quatre jours après germination, la racine en croissance pénètre dans un canal baigné d'un flux de milieu nutritif ayant été (test) ou non (contrôle) au contact d'une souche fongique fournie par l'IBWF Kaiserslautern. Un système de prises de vues sous loupe, et d'analyse d'images permet de calculer la vitesse de croissance. Lorsqu'un perfusat nutritif induira un blocage ou une accéleration de croissance par rapport au témoin, l'étude se poursuivra à l'échelle microscopique par l'analyse du cytosquelette microtubulaire et d'actine des cellules de la racine et par la détection d'événements éventuels de mort cellulaire. Pour ce faire, des biopuces montées cette fois sur lamelles de verre seront utilisées avec des plantes d'Arabidopsis transgéniques dans lesquelles l'un des marqueurs fluorescents (TUB6-GFP ; TUA6-mcherry ; fimbrine-GFP ; lifeAct-RFP) - obtenus à l'IBMP, Strasbourg - s'associent aux protéines cytosquelettiques de façon à déterminer les corrélations entre les modifications de croissance et le comportement des composants intracellulaires impliqués dans la croissance. Sachant que les microtubules corticaux contrôlent l'axialité de l'expansion cellulaire alors que l'actine contrôle le flux polaire de l'hormone de croissance auxine, tout composé pouvant inhiber l’un ou l’autre de ces polymères est un candidat potentiel comme bio-herbicide. Ces analyses in vivo permettront donc d'identifier les cascades signalétiques induites produisant les symptômes observés.




Literaturquelle

Duan D, Fischer S, Merz PR, Bogs J, Riemann M, Nick P (2016) An ancestral allele of grapevine transcription factor MYB14 promotes plant defence. J Exp Bot 67, 1795-1804





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