Bioaktivitäts-Tests für Abwehr und Wachstumsregulation

Forschungsthema



In unserem Projekt sollen Extrakte und Wirkstoffe aus Pilzen, aber auch pflanzlichen Ursprungs auf ihre biologische Wirkung untersucht werden, teilweise auch Stoffe, die in bestimmten Kombinationen aus pflanzlichen oder pilzlichen Zellen gebildet werden. Hierfür benötigen wir Testsysteme, mit denen wir eine solche Wirkung schnell, einfach, zuverlässig und in kleinen Testvolumina durchführen können. Diese Aufgabe wollen mir mit einer Art Hybrid aus Chip und einem sogenannten biologischen Reporterbewältigen, ein Ansatz, der aus der Synthetischen Biologie entlehnt ist. Pflanzen oder Pflanzenzellen werden so „umgebaut“, dass man an ihnen auf einfache Weise „ansehen“ kann, ob sie ihr Immunsystem aktivieren oder ob sie ihr Wachstum umsteuern.

Um die Aktivierung der Immunität verfolgen zu können, werden am Botanischen Institut des KIT Pflanzenzellen mit einem Genkonstrukt ausgestattet, das nach Aktivierung der pflanzlichen Abwehr eine grüne Fluoreszenz erzeugt, die man dann messen kann. Dafür benutzen wir den Transkriptionsfaktor MYB14. Dieser Genschalter aus der Weinrebe wird immer dann gebildet, wenn die sogenannte basale Immunität anspringt, eine Art Breitbandabwehr, die gegen viele Krankheitserreger wirksam ist. Wir nutzen eine besonders wirksame Version dieses Schalters, die wir in einem vorangegangenen Interreg-Projekt (BACCHUS) aus der vom Aussterben bedrohten Europäischen Wildrebe (Vitis sylvestris) isoliert haben. Die Steuersequenz von MYB14 wird vor ein Genstück gesetzt, das für das Grün Fluoreszierende Protein kodiert. Dieses Protein stammt ursprünglich aus einer Qualle und ist für das sogenannte Meeresleuchten verantwortlich. Immer dann, wenn einer unserer Testsubstanzen die basale Immunität aktiviert, wird die Steuersequenz von MYB14 aktiv und die Zelle bildet das Grün Fluoreszierende Protein, was dann zu einem grünen Leuchten führt, das wir beobachten und messen können. Inzwischen haben wir das oben beschriebene Genkonstrukt hergestellt und in Tabak-BY-2 Zellen eingeführt. Im nächsten Schritt müssen wir dieses Reportersystem „eichen“. Dazu werden diese gentechnisch veränderten Zellen mit verschiedenen Mengen von flg22 behandelt, einem bakteriellen Peptid, von dem wir aus vorangegangenen Arbeiten wissen, dass es die basale Immunität aktiviert. Nach der „Eichung“ muss unser Reportersystem in den Mikrofluidikchip eingebaut werden und dann können wir damit beginnen, die vom IBWF Kaiserslautern bereitgestellten Pilzstämme zu messen.
Um die Wirkung eines Pilzes oder einer Pflanzenverbindung auf das Pflanzenwachstum zu erfassen, muss ein Messsystem entwickelt werden. In diesem Projekt werden wir die Wachstumsfähigkeit und die Wachstumsraten der Samen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, auch Ackerschmalwand genannt, messen, die so klein ist, dass die Keimlinge in den Chip integrierbar sind. Dazu werden die Samen einzeln in mit Agar gefüllte Kunststoffspitzen ausgesät und auf einen auf einem Glasträger montierten Biochip gelegt, der vom KIT - Institut für Mikrostrukturtechnologie gefertigt wird. Vier Tage nach der Keimung tritt die wachsende Wurzel in einen Kanal ein, der in einen Nährmediumstrom entweder mit oder ohne Kontakt mit einem Pilzstamm des IBWF Kaiserslautern gebadet wird (Test bzw. Kontrolle). Unter einem Vergrößerungsglas werden Bilder aufgenommen, die anschließend analysiert werden um daraus die Wachstumsgeschwindigkeit zu berechnen. Wenn ein Nährstoff-Perfusat eine Blockade oder eine Wachstumsbeschleunigung im Vergleich zur Kontrolle auslöst, wird die Studie auf mikroskopischer Ebene durch die Analyse des mikrotubulären Zytoskeletts und des Aktins der Wurzelzellen und durch die Erkennung möglicher Zelltod-Ereignisse fortgesetzt. Dazu werden Biochips mit transgenen Arabidopsis-Pflanzen verwendet, bei denen sich einer der am IBMP, Strassburg, erhaltenen Fluoreszenzmarker (TUB6-GFP; TUA6-Kirsche; Fimbrin-GFP; lifeAct-RFP) mit Zytoskelett-Proteinen verbindet, um die Korrelationen zwischen Wachstumsveränderungen und dem Verhalten der am Wachstum beteiligten intrazellulären Komponenten zu bestimmen. Diese in vivo-Analysen werden eine Dynamik der induzierten zellulären Effekte feststellen. Da man weiß, dass kortikale Mikrotubuli die Axialität der Zellexpansion kontrollieren, während Aktin den polaren Fluss eines Wachstumshormons (Auxin) steuert, ist jede Verbindung, die in der Lage ist, eines dieser Polymere zu hemmen, ein potenzieller Kandidat, wie z.B. ein Bio-Herbizid. Diese in vivo-Analysen werden es daher ermöglichen, die Signalkaskaden zu identifizieren, die induziert werden und die die beobachteten Symptome hervorrufen.




Literaturquelle

Duan D, Fischer S, Merz PR, Bogs J, Riemann M, Nick P (2016) An ancestral allele of grapevine transcription factor MYB14 promotes plant defence. J Exp Bot 67, 1795-1804





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